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測試表征系列丨一文詳解MTT法和CCK－8法測定細胞毒性和增殖的優劣

來源：科學10分鐘時間：2021-07-01 14:38:03 瀏覽：26852次

MTT法檢測

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。

CCK-8法檢測

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，一種類似于MTT的化合物）的細胞增殖與活性檢測試劑盒，用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測。在電子耦合試劑存在的情況下，WST被線粒體內的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培養基中。細胞若增殖越多越快，則培養基的顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，生成甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。應用酶標儀測定吸光值（450nm）并進行統計學計算便可以獲得細胞毒性相關數據。

CCK-8與MTT比較

（1） CCK-8 試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全，重現性好的細胞增殖與活性檢測方法。與傳統的MTT相比，無需有機溶劑和放射性同位素，步驟少，無損失，結果準確！

（2）MTT 實驗生成的甲瓚不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有機溶劑溶解后才能檢測；而CCK-8法產生的甲瓚是水溶性的，不僅省去了溶解的步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

（3）與 MTT 方法相比， CCK-8法線性范圍更寬，靈敏度更高。

（4）CCK-8法對細胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時間。且CCK8法所用試劑在培養基中比 MTT 更加穩定，實驗效果重復性好。

（5）MTT 具有毒性，同時其生成的甲瓚需要有機溶劑溶解，溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害，會對操作人員身體造成毒害，WST-8無毒，使用中無需有機溶劑，操作更加安全。

（6）CCK-8試劑盒在 4℃避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。MTT一般最好現用現配，過濾后4℃避光保存兩周內有效。

CCK-8試劑使用方法

一、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。

2、按比例(例如:1/2 比例)依次用培養基等比稀釋成細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標(X 軸)，OD值為縱坐標 (Y 軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(適用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養時間要一致)。

二、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（37 °C， 5% CO2）。

2、向每孔加入 10 μL 的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數）。

3、將培養板在培養箱內孵育 1-4 小時。

4、用酶標儀測定在 450nm 處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24 小時內吸光度不會發生變化。

三、細胞增殖-毒性檢測

使用方法（以96孔板為例，其他規格培養板按實際情況安排）：

1、在96孔板中配制100μl的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μl 2000個細胞，細胞毒性實驗每孔100μl 5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度等因素決定）。按照實驗需要，進行培養（在 37 °C，5%CO2的條件下）預培養24小時。

2、向培養板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。

3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24或48小時）。

4、每孔加入10μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。如果起始的培養體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養液和 CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作空白對照。如果擔心所使用的藥物會干擾檢測，則需設置加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。

5、在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，對于大多數情況，孵育 1 小時即可。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在 0.5、1、2 和4小時候分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm 的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M 的 HCL溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24 小時內吸光度不會發生變化。

8、注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收可。

活力計算：

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0 加藥） -A（空白）] ×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養基和 CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

1、使用 96 孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意培養基蒸發：一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加 PBS，水或培養液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。

2、 CCK-8 檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。

3、建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。

4、建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加樣，溶液產生氣泡，會干擾OD值讀數。

5、當使用標準 96 孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μl 培養基）。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2500 個/孔（100μl 培養基），且培養時間可適當延長。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色已變化或 PH 值變化，建議換用新鮮的培養基。

7、如果沒有 450nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之間的濾光片，但是 450nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

8、酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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技術顧問劉老師：19113235271（微同）

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