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    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）

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    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）

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    項(xiàng)目介紹

    WB（Western Blot，蛋白質(zhì)印跡法）實(shí)驗(yàn)是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的特性來檢測特定蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。基本原理是經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。


    樣品要求

    1、新鮮樣品：1、100mg（至少）新鮮組織，干冰運(yùn)輸；

    2、細(xì)胞：細(xì)胞類型樣本細(xì)胞數(shù)為1-2*107以上，收集細(xì)胞后PBS清洗三遍，離心去除上清，干冰運(yùn)輸；

    3、血液樣品： 樣品無潛在性攜帶病原體和病毒。如果存在病毒的可能性，請滅活處理；

    （1）全血：采集新鮮血液，建議全血樣品用全血樣品RNA提取試劑盒抽提RNA，或者新鮮血液分離白細(xì)胞；處理后的樣本放入干冰或者﹣80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸寄送。

    （2）血漿：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，4℃ 4000rpm離心5分鐘，上層為血漿樣本，按每200μl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸寄送。

    （3）血清：用非抗凝管收集血樣，靜置分離上層血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸寄送。

    4、蛋白樣品：未變性的蛋白需要存入-80°C ，干冰運(yùn)輸寄送；Loading Buffer煮沸的蛋白，需要提供蛋白濃度(濃度需在5μg/μl 以上，200μl樣品)，冰袋運(yùn)輸寄送。

    5、植物組織樣品：選取新鮮組織，200mg以上組織，盡量避免衰老，病變，發(fā)霉的組織；將樣品剪成小塊放入液氮預(yù)冷的螺口離心管中，在液氮中速凍5min，-80度保存，干冰運(yùn)輸寄送。

    6、菌體：收集菌體到1.5ml的離心管內(nèi)，離心去上清，用1*pbs洗滌三次，液氮速凍5min后，-80度保存。

    項(xiàng)目案例

    常見問題
    1、1、為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預(yù)期的不同？

    答：蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般來講，蛋白質(zhì)越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實(shí)際條帶大小可能與預(yù)測的不同。

    常見的因素包括：

    1.翻譯后修飾：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質(zhì)大小。

    2.翻譯后切割：例如許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產(chǎn)生活性形式，例如前半胱天冬酶。

    3.剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

    4.相對電荷-氨基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質(zhì)的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強(qiáng)相互作用會(huì)導(dǎo)致較大的條帶出現(xiàn)。

    2、2、蛋白樣本為什么要進(jìn)行還原和變性？

    答：為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會(huì)含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結(jié)構(gòu)，變成初級的氨基酸結(jié)構(gòu)，同時(shí)以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu)，此圖中簡單地展示了這一過程。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性。所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進(jìn)行。

    3、3、為什么檢測重組蛋白時(shí)難以獲得條帶？

    答：抗體檢測重組蛋白質(zhì)時(shí)，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達(dá)的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時(shí)，如果重組蛋白帶有標(biāo)簽，標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

    4、4、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

    答:抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會(huì)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因?yàn)锽SA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因?yàn)榕Ｄ毯懈喾N類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）

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