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    實時熒光定量PCR實驗中會出現的問題有哪些？
    來源：測試GO 時間：2022-10-28 11:34:10 瀏覽：4979次

    在科研人員進行實時熒光定量PCR的實驗操作中遇到了不計其數的問題，本文就給大家分享在實驗過程中出現頻率最高的一些問題：

     內參基因COL1(擴增曲線)

    一、Ct值出現

    檢測熒光信號的步驟有誤:一般SybrGreen法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。

    1、引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。

    2、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

    3、模板降解:避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

    二、Ct值出現過晚（Ct>38）

    1、擴增效率低:反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

    2、PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

    3、PCR產物太長:一般采用80-150bp的產物長度。

    三、溶解曲線不止一個主峰

    1、引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

    2、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

    3、鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

    4、模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

    四、擴增效率低

    1、反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

    2、反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

    3、反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。


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    12條評論
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    全部 3小時前 四川
    文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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