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生物樣本透射電鏡測試的各類樣品制備方法

來源：時間：2024-11-05 10:52:15 瀏覽：5510次

生物樣本透射電鏡測試的各類樣品制備方法

生物樣本透射電鏡（Transmission Electron Microscopy，簡稱TEM）是一種利用電子束穿透樣品進行成像和分析的顯微技術(shù)，具有極高的分辨率，能夠觀察到細胞結(jié)構(gòu)、病毒、蛋白質(zhì)等生物樣品的納米級細節(jié)；為了獲得高質(zhì)量的TEM圖像，樣品的制備至關(guān)重要。

一、概述

透射電鏡樣品制備的基本目標(biāo)是保持生物樣品的自然狀態(tài)，同時提高樣品的電子透明度，以便電子束能夠穿透并產(chǎn)生清晰的圖像；制備過程通常包括固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色和安裝等步驟。

二、樣品制備方法

（一）固定

固定是樣品制備的第一步，目的是迅速殺死細胞，并盡可能保持其生前狀態(tài)；常用的固定劑有戊二醛和鋨酸，戊二醛能快速穿透細胞，固定細胞質(zhì)和細胞膜，而鋨酸則固定細胞核和細胞器。

1. 戊二醛固定：將樣品置于2.5%的戊二醛溶液中，4℃下固定數(shù)小時至過夜。

2. 鋨酸固定：戊二醛固定后，用鋨酸進行后固定，通常在4℃下進行1-2小時。

（二）脫水

脫水是為了去除細胞中的水分，以便后續(xù)的滲透和包埋。常用的脫水劑有乙醇和丙酮，濃度從30%逐漸增加到100%。

（三）滲透

滲透是將脫水劑替換為能與包埋劑相容的溶劑，如環(huán)氧樹脂，使包埋劑能夠滲透到細胞內(nèi)部。

（四）包埋

包埋是將樣品嵌入到固體介質(zhì)中，以便進行切片。常用的包埋劑有環(huán)氧樹脂、聚酯樹脂等。

（五）切片

切片是將包埋好的樣品切割成超薄（通常50-100納米）的切片，以供TEM觀察。切片方法有超薄切片和冷凍切片等。

1. 超薄切片：使用超薄切片機，如萊卡UC6或鉆石刀，獲得超薄切片。

2. 冷凍切片：在冷凍狀態(tài)下，使用冷凍切片機切割樣品。

（六）染色

染色是為了增強樣品的對比度，使其在TEM下更容易觀察。常用的染色劑有醋酸鈾、檸檬酸鉛等。

（七）安裝

將染色后的切片安裝在TEM專用的銅網(wǎng)或微柵上，準(zhǔn)備進行TEM觀察。

三、特殊樣品制備方法

1. 細胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的標(biāo)記：對于需要觀察細胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的情況，可以使用免疫金標(biāo)記、免疫電子顯微鏡技術(shù)等對目標(biāo)結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記。

2. 原位雜交：原位雜交技術(shù)可用于檢測細胞內(nèi)特定的RNA或DNA序列，結(jié)合TEM技術(shù)，可以觀察到特定序列在細胞內(nèi)的分布。

3. 冷凍斷裂技術(shù)：冷凍斷裂技術(shù)適用于研究細胞膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。樣品在冷凍狀態(tài)下斷裂，暴露出細胞膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，然后進行TEM觀察。

四、注意事項

1. 在整個制備過程中，要盡量減少對樣品的損傷，保持其原始結(jié)構(gòu)。

2. 確保固定、脫水、滲透、包埋等步驟的試劑和設(shè)備清潔，避免污染。

3. 切片時要保證切片的厚度均勻，以便獲得高質(zhì)量的TEM圖像。

4. 染色過程中要控制染色時間，避免過度染色。

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